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古朵實驗:免疫熒光染色背景色太強如何解決?

發布時間:2020-04-09浏覽次數:1445返回列表

免疫熒光染色是一種常用的一種生物化學檢查方法,常用于組織學中抗原或抗體的定位,也可用于體液標本中抗原或抗體的定量檢測。許多小夥伴,在做免疫熒光染色實驗時,碰到各種各樣的問題。事實上,掌握了免疫熒光染色實驗的原理、操作步驟及注意事項,要成功完成一項免疫熒光染色實驗並不難。

1、免疫熒光技術是什麽?

免疫荧光技术(Immunofluorescence technique )又称荧光抗体技术,主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白。免疫荧光技术既有抗原抗体反应的高度特异性,又能在荧光显微镜下清晰地显示其形态,直观性强。

免疫熒光染色實驗有兩種,包括直接免疫熒光法和間接免疫熒光法。

免疫荧光染色背景色太强如何解决?详解实验操作及注意事项

免疫熒光法原理圖

直接免疫熒光法是zui早的方法。其基本原理是用已知的抗體標記上熒光素後成爲特異性熒光抗體,染色時將該抗體直接滴在載玻片上進行孵育,使之直接與載玻片上的抗原結合,在熒光顯微鏡下直接觀察,作出判斷。

間接免疫熒光法的基本原理是用特異性的抗體與切片中的抗原結合後,繼用間接熒光抗體,與前面的抗原抗體複合物結合,形成抗原抗體熒光複合物。在熒光顯微鏡下,根據複合物的發光情況來確定所檢測的抗原。

两种方法,基本原理是一样的。免疫荧光 (IF) 或细胞成像技术使用抗体将荧光染料(也称为荧光素或荧光物)标记到特异性目标抗原上,所用荧光染料有诸如异硫氰酸荧光素 (FITC) 等。而通过化学方法偶联荧光素的抗体被广泛使用于IF实验中。

直接免疫熒光法簡單易行、特異性高、快速方便,常用于腎活檢組織幾種免疫球蛋白的檢測和病原體的檢測。但其不足是只能檢測相應的一種物質,敏感性較差,效果有時不理想。

間接免疫熒光法由于結合在抗原抗體複合物上的熒光素抗體增多,發出的熒光亮度強,因而其敏感性強。所以間接免疫熒光法geng加常用,只需制備一種種屬熒光抗體,即可適用于多種第1抗體的標記顯示。

2、免疫熒光染色實驗操作步驟

免疫熒光染色的操作方案通常包括:固定和透化、封閉、一抗孵育、洗滌、二抗孵育、再次洗滌以及測定讀數。本文以間接免疫熒光法爲例,講講從固定到封片每個步驟的原理。

1)样品准备(Sample preparation)

對于貼壁細胞:可以直接用多孔板,例如6孔板、24孔板等,培養細胞,然後到預定時間時進行固定等後續操作。也可以用潔淨的蓋玻片,70%乙醇中浸泡後,用無菌的鑷子放置到6孔板內,然後用無菌的生理鹽水、PBS或培養液洗去殘留的乙醇。這時就可以種入細胞進行培養,待細胞貼在蓋玻片上生長良好後,即可進行固定等後續操作。

對于懸浮細胞:把細胞先在固定液中固定,然後把細胞滴加在載玻片上,幹燥後細胞會緊貼在載玻片上。然後就可以進行後續操作。如果細胞的粘附能力不佳,可以在載玻片上用PDL等物質進行處理,以增強載玻片的粘附能力。

對于冷凍切片:切片放置在載玻片上後,可以直接進行固定等後續操作。

對于石蠟切片:切片在二甲苯中脫蠟5分鍾,再換用新鮮的二甲苯脫蠟,共用二甲苯脫蠟3次。無水乙醇5分鍾,兩次。90%乙醇5分鍾,兩次,70%乙醇5分鍾,一次。蒸餾水5分鍾,兩次。

抗原修复:根据不同的抗原和抗体,可以选择把切片放置在如下抗原修复液中,10mM柠檬酸钠,pH6.0,或1mM EDTA,pH8.0,或10mM Tris, pH10.0,95℃加热12分钟,大约在30分钟内缓慢冷却至室温。

2)固定

目的是保留組織的原始結構,維持細胞形態和抗原的細胞分布。當組織細胞死亡時,細胞發生分解,從其溶酶體和其他細胞器中釋放的酶,可以水解組織,這一過程稱爲自溶。爲了避免這種情況,固定組織細胞很有必要。

可以使用適當的固定液固定細胞或切片,固定完畢後,可以用免疫染色洗滌液(P0106)洗滌兩次,每次5分鍾。常用的固定劑有甲醛,戊二醛,甲醇/丙酮。不同固定劑所需時間和濃度不一,需要根據具體實驗進行探索。

3)破膜

破膜是为了让抗体能与抗原有机会相见。因为免疫染色的基本原理就是让抗原抗体相结合,然后标记的抗体通过发荧光,使得我们可以对目的蛋白进行定性或定量分析。如果要检测的抗原在细胞膜外表面或细胞外基质,那么可以省去破膜步骤。因为在不破膜的情况下,抗体也能有机会与抗原结合。但是,如果需要检测的抗原在细胞内,则需要破膜,将细胞暴露于针对目的蛋白的第1抗体,以确保抗体可进入表位。常用的破膜剂有Triton X-100, NP-40, Brij-58, 皂苷, 洋地黄皂苷, 甲醇/丙酮。同样,应根据具体实验进行破膜剂的选择。

4)封閉(Blocking)

封閉是使一抗的非特異性結合zui小化的重要步驟。在使用特異性的一抗與目的蛋白結合的過程中,如果有非特異性結合,則可能出現假陽性結果,較強的背景染色也會幹擾目的染色的呈現,影響實驗結果的判斷。從理論上講,任何不結合靶抗原的蛋白質都可以用于封閉。血清是一種常見的封閉劑,因爲它含有與非特異性位點結合的抗體。用血清或蛋白質封閉劑封閉可防止抗體與組織或Fc受體非特異性結合。

從封閉開始所有的步驟,一定要注意樣品的保濕,避免樣品的幹燥,否則極易産生較高的背景。

5)一抗孵育(Primary antibody incubation)

事先選擇的特異性一抗可以與目的蛋白結合。這一步需要注意的是一抗是抗什麽物種的。如果組織細胞來源是小鼠,則一抗應該是某種動物抗小鼠,這裏的某種動物是指一抗宿主,比如,一抗是羊抗小鼠,羊便是一抗宿主。

6)二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

第1抗體孵育後,洗掉未結合的一抗抗體,便可以進行一抗與二抗的結合。二抗應該是針對第1抗體宿主物種的,熒光標記的第二抗體。例如,一抗是羊抗小鼠,二抗應該是某種動物抗羊,比如兔抗羊。

如果進行的是雙染,就要注意一抗二抗宿主的選擇,不要使其有交叉結合的可能。比如,組織來源是小鼠,有兩個目的蛋白需要檢測,一抗宿主應該要不一樣,二抗應有不同熒光標記。針對A目的蛋白的一抗是羊抗小鼠,針對B目的蛋白的一抗可以是大鼠抗小鼠(大鼠和羊是不同一抗宿主),A二抗是帶有綠色熒光的兔抗羊二抗,B二抗是帶有紅色熒光的兔抗大鼠二抗,這種搭配是可以的。在熒光顯微鏡下,A目的蛋白染成了綠色,B目的蛋白則染成了紅色。但是,如果B一抗也是羊抗小鼠,則A二抗也會與B一抗結合,這時候就亂了,熒光鏡下一片綠。

7)封片

封片是指免疫染色後,使用固定介質將蓋玻片粘附到組織切片或細胞塗片上。封片可以保護已染色的標本,以免受到物理損害。進行封片的固定介質也有助于提高顯微鏡下圖像的清晰度和對比度。

8)蛋白检测(Detection of proteins)

對于免疫熒光染色,此時已經可以直接到熒光顯微鏡下觀察。

免疫荧光染色背景色太强如何解决?详解实验操作及注意事项

3、三種細胞免疫熒光染色實驗操作舉例

zo-1的免疫熒光

1)細胞在蓋片上生長融合到95%-時,從孵箱中取出。

2) 用预温的1×PBS洗3次,每次10分钟

3)4%的甲醛室溫固定20-30分鍾

4)1×PBS洗3次,每次10分鍾

5) 0.2%Triton X-100透化2-5分钟

6)1×PBS洗3次,每次10分鍾

7. 5%BSA室温封闭30分钟

8) 加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里,4度过夜

9)1×PBS洗3次,每次10分

10)加二抗(用1%BSA稀釋)30分鍾,閉光!!!

11)1×PBS洗3次,每次10分鍾

12) 95%甘油封片

注:4%甲醛,0.2%Triton,5%BSA均用1×PBS稀釋"

細胞爬片的免疫熒光

1)取出細胞爬片放到35mm或60mm用過的培養皿裏,PBS洗三遍。

有的时候作的细胞爬片可能比较小,夹取的时候要小心,注意 反正面,放在皿里洗比较方便,避免了来回夹取,另外洗的时候加PBS不要太冲,不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS,稍晃一下就倒掉,没有等5分钟或10分钟。

2) 4%冷的多聚甲醛固定20分钟,PBS洗三遍。

3)0.2%Triton X-100通透10分钟,PBS洗三遍。

4) 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟,PBS洗三遍。

5)一抗4度濕盒內過夜,也可37度2小時,感覺前者效果hao,PBS洗三遍。

6)二抗室溫2小時(避光),或者37度1半小時,PBS洗三遍。

7)zui好用DAPI染核,然後直接照熒光片。

8)蒸餾水洗掉PBS,甘油封片,指甲油封片子的四周,因爲甘油不象樹脂那樣會幹,所以不用指甲油封的話會弄的一塌糊塗。

細胞免疫熒光簡單實驗

1)漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.

2)-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟

3)PBS洗淨:3min*3

4)1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS

5)PBS洗淨:2*5min

6)羊血清封閉:37度,20分鍾

7)一抗,4度過夜,一般要大于18小時或者37度1-2小時

8) 4度PBS洗净,3min*5次

9)二抗37度小于一小時

10) 37度PBS洗净,3*5min凉干封片(封闭液PH8.5)

不管采用何種方法,在使用PBS緩沖液漂洗時,都要漂洗幹淨並且要測下pH值,可以使用PBS多清洗幾次,也可以延長PBS清洗時間,如果結果背景較高可以延長漂洗的次數和時間。

4、免疫熒光染色操作注意事項

1)熒光試劑要放好

盡管許多熒光基團具有相對的光穩定性,但在保存和染色過程中若未能避光,則可能導致熒光基團-抗體結合物降解,引起假陰性結果。因此,熒光物質必須在建議溫度下小心保存,並始終注意避光,以保護其光譜完整性。

2)選擇熒光要謹慎

免疫熒光技術的一個主要優勢在于它爲多重檢測提供了機會,如今流式細胞儀能檢測每個細胞中20多個離散參數。在設計多重實驗時,應考慮每種熒光基團的獨特性質,如zui大吸收波長和zui大發射波長,消光系數和斯托克斯位移等因素。

3)合適對照不可少

任何实验数据的分析都依赖于相关的对照,免疫荧光染色也不例外。每次试验时 ,需设置以下三种对照:

(1) 阳性对照:阳性血清+荧光标记物

(2) 阴性对照:阴性血清+荧光标记物

(3) 荧光标记物对照:PBS+荧光标记物

5、免疫熒光實驗常見問題排除指南

1)背景染色太強

背景染色太強是指除了我們想看到的特異性染色在前台唱主角演戲,還有一堆吃瓜群衆(與想看到的特異性染色顔色相同)在後面搶戲。

是什麽原因導致這些戲精搶了主角的戲呢?可能的原因如下。

組織切片太厚:這種情況下可以選擇將組織切片變薄試試。

封閉不佳:封閉的目的就是爲了減少非特異性的結合,減少背景染色。如果背景太強,可以考慮換種封閉液或者增加封閉孵育的時間

二抗有非特异性结合:要想验证是否如此,可以在染色过程中做个只加二抗的空白对照(也就是说不用特异性的一抗进行一抗的孵育过程,比如用一抗稀释液进行孵育一抗的步骤). 如果空白对照有染色,说明二抗有非特异性结合,这时候建议geng换一种二抗。

自体荧光:想知道组织是否有自体荧光,查看在非染色区域是否有荧光即可。有些自体荧光来自固定步骤,可以避免使用戊二醛固定,或者使用含0.1% 氢硼化钠的PBS洗涤以除去游离的醛基。还有些荧光来自内源性的荧光分子,可以用苏丹黑/硫酸铜进行光漂白。

抗體濃度太高:降低所使用的抗體濃度或調整孵育時間。

洗滌不充分:染色有很多步驟,其中又包括很多洗滌的步驟。在實驗過程中,確保洗滌到位,不要偷工減料。

2)染色較弱或沒有染色

可能的原因如下:組織本身不存在你想研究的目的蛋白或者表達量很少。

如果懷疑目的蛋白並不存在,可以通過多種方式驗證,比如WB。因爲不同探究蛋白的實驗的原理和操作會不一樣,所以可能得到的結果會不一樣,多種實驗的驗證geng有可能避免假陰性的出現。如果目的蛋白表達量很少,則可以考慮增加一個擴大熒光信號的步驟。

熒光顯微鏡的問題。

如果對熒光顯微鏡的參數設置不對,有可能導致看不到熒光。比如光源/濾光設備與你想檢測的熒光不匹配。每次拍照,記得檢查參數是否有誤。

曝光時間太短或吸光太少(gain值太低):可以嘗試調大Gain值並/或增加曝光時間,找到zui佳值。

曝光時間太長,出現熒光淬滅:避免讓切片過度曝光。使用完立即將切片保存在黑暗處。

細胞/組織固定過度:因爲過度固定可以讓抗原表位帶上面具,使得抗體無法與抗原結合,這樣當然就沒啥熒光啦。所以可以嘗試減少固定的時間,也可以嘗試做抗原修複以顯現抗原表位。

組織/細胞幹透:確保整個染色過程中,切片都處于潮濕環境。

细胞没有通透,一抗进不去:举例来说,如果你想研究的目的蛋白在细胞里面,但是抗体因为没有金刚钻,不能进入细胞里与目的蛋白长相厮守,那么你当然看不到它们的爱情闪光点。所以呢,可以想办法让细胞开通绿色通道,搭个鹊桥。比如,如果使用甲醛固定组织细胞,可以用0.2% Triton X-100(不同实验可能所需浓度不一)通透细胞。如果是用甲醇或者丙酮固定的组织细胞,则不需要使用Triton X-100,因为前者可以通透细胞。

一抗量不夠/孵育時間太短:提高抗體的濃度或增加孵育時間

一抗不合適:購買一抗前,記得閱讀産品信息,不是所有一抗都可以進行免疫熒光染色實驗的。另外,確保産品沒有過期。

一抗二抗不兼容:舉例來說,如果你的組織來源是小鼠,那麽一抗應該是某種動物抗小鼠,比如山羊抗小鼠,那麽,此時二抗應該是某種動物抗山羊,比如兔抗山羊。也就是說,二抗應該是抗一抗宿主的。

切片储存时间过长:样品染色后应该尽快观察拍照,否则信号会随时间减弱。可以考虑将切片保存在 4?C 避光处,尽量延长储存时间。

抗體儲存問題:避免反複凍融抗體,因爲可能會引起抗體出現降解。建議買了抗體後,根據實驗每次的需求,將抗體分成多個小份保存,這樣每次使用一個小管即可。另外,儲存前記得看說明書,根據說明書的指示進行保存。比如具體保存溫度,是否要避光等。

小結:希望上面這些小貼士,能幫助大家成功完成免疫熒光染色實